コーディングと非の包括的な分析

Apr 26, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9252 (2023) この記事を引用

122 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ウィルソン病 (WD) は、遺伝的根拠を持つ常染色体劣性遺伝疾患です。 WD の主な非運動症状は認知機能障害ですが、具体的な遺伝的調節機構は依然として不明です。 Tx-J マウスは、ATP7B 遺伝子とヒト遺伝子の配列相同性が 82% であり、WD に最も適したモデルと考えられています。 この研究では、ディープシークエンシングを利用して、コーディングと非コーディングの両方のRNA転写プロファイルの違い、およびWD認知障害に関与する制御ネットワークの機能的特徴を調査しています。 tx-J マウスの認知機能は、水迷路テスト (WMT) を使用して評価されました。 tx-J マウスの海馬組織における長鎖非コード RNA (lncRNA)、環状 RNA (circRNA)、およびメッセンジャー RNA (mRNA) プロファイルを分析し、差次的に発現する RNA (DE-RNA) を同定しました。 その後、DE-RNA を使用して、タンパク質間相互作用 (PPI) ネットワーク、DE-circRNA および lncRNA に関連する競合内在性 RNA (ceRNA) 発現ネットワーク、およびコーディング-非コーディング共発現 (CNC) ネットワークを構築しました。 それらの生物学的機能と経路を解明するために、PPI および ceRNA ネットワークをジーンオントロジー (GO) および京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG) の経路解析に供しました。 合計 361 個の差次的に発現された mRNA (DE-mRNA) (193 個の上方制御された mRNA と 168 個の下方制御された mRNA で構成)、2,627 個の差次的に発現された長鎖非コード RNA (DE-lncRNA) (1,270 個の上方制御された mRNA と 1,357 個の下方制御された mRNA で構成) lncRNA、および上方制御される circRNA 68 個と下方制御される 31 個の circRNA からなる 99 個の差次的に発現される環状 RNA (DE-circRNA) が、コントロール マウス グループと比較した場合、tx-J マウス グループで観察されました。 遺伝子オントロジー (GO) および経路解析により、DE-mRNA が細胞プロセス、カルシウムシグナル伝達経路、および mRNA 監視経路に豊富に存在することが明らかになりました。 対照的に、DE-circRNAs 関連の競合内在性 RNA (ceRNA) ネットワークは共有結合的クロマチン修飾、ヒストン修飾、および軸索ガイダンスが豊富であったのに対し、DE-lncRNAs 関連の ceRNA ネットワークは細胞形態形成の制御に関与する樹状突起スパインが豊富でした。分化およびmRNA監視経路における。 この研究では、tx-J マウスの海馬組織における lncRNA、circRNA、および mRNA の発現プロファイルが示されました。 さらに、この研究ではPPI、ceRNA、およびCNC発現ネットワークを構築しました。 この発見は、認知障害に関連するWDにおける調節遺伝子の機能を理解する上で重要である。 これらの結果は、WD の診断と治療に貴重な情報も提供します。

ウィルソン病 (WD) は、ATP7B 胆管銅トランスポーターの変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患で、組織内に過剰な銅 (Cu) の蓄積を引き起こします。この疾患は、1912 年にキニア ウィルソンによって導入されました1。ATP7B 遺伝子は P 型 ATPase です。体内の銅濃度を適切に維持することができます。 この遺伝子の変異により、肝臓、脳、角膜、腎臓などのさまざまな組織や器官に銅が蓄積します2。 したがって、WD の臨床症状は、無症候性の状態から肝臓、神経、眼、精神的な症状までさまざまです。 肝疾患は、ウィルソン病（WD）の最初の臨床症状として現れることがあり、無症候性の肝酵素の上昇、急性肝炎、重度の肝炎、代償性/非代償性肝硬変、さらには急性肝不全などのさまざまな症状を伴います4。 肝症状に続いて、神経症状が最も一般的な臨床症状であり、振戦、ジストニア、パーキンソニズムなどのさまざまな程度の運動障害や、構音障害、嚥下障害、精神障害、認知機能障害、人格障害などの非運動機能障害として現れます。 、等５． 眼の病理学的銅沈着は、カイザー・フライシャー環やヒマワリ白内障など、WD に典型的な眼科症状を引き起こす可能性もあります 6。 さらに、心臓内の銅の沈着は不整脈や心筋症などを引き起こす可能性があります。 腎臓病は尿細管機能不全、腎臓結石、高カルシウム尿症などを引き起こす可能性があります。 骨格系は、骨粗鬆症、軟骨カルシウム、変形性関節症などとして現れる可能性があります。 女性の生殖器系では、月経不順、不妊症、習慣性流産などを引き起こす可能性があります。7. 認知機能障害は、神経系における主な非運動症状です。 カークら。 彼らは、認知障害が表現型に関係なく、安定したWD患者の半数以上に存在し、疾患の長期経過中に持続することを発見した8。 治療可能な数少ない先天性遺伝病の 1 つである WD は、早期診断とタイムリーな治療によって効果的な制御が促進される可能性があります9。

私たちの研究では、tx-J マウスを動物モデルとして使用しました。 ジャクソン研究所が実施した研究によると、海馬における銅の蓄積により、tx-J マウスの行動障害と記憶障害が引き起こされました10。 以前の研究では、tx-J マウスの海馬ニューロンにおけるミトコンドリア オートファジーの過剰活性化が認知機能障害を引き起こす可能性があることも確認されています 11。 さらに、別の研究では、ヒトの 82% と tx-J マウスの 91% が、銅輸送 ATPase を含む機能ドメインを持つ WND タンパク質の同じアミノ酸配列を共有していることが報告されました12。 したがって、tx-J マウスは WD を研究するための有効なモデルです。

ノンコーディング RNA は、現在の神経科学分野で注目されている要素です。 それらはタンパク質コード機能を欠いていますが、クロマチン構造 13、RNA/タンパク質足場、スポンジおよびエピジェネティックな修飾、選択的スプライシングなどを通じて転写と翻訳を制御できます 14。 ノンコーディング RNA および関連する遺伝子制御ネットワークの多様性と複雑さは、生理学的病状の制御において重要な役割を果たしています 15。 海馬の老化の遺伝子発現プロファイルを調査した研究では、免疫グロブリンの調節異常が海馬の老化の潜在的なメカニズムである可能性があり、老化プロセスにおける海馬に焦点を当てた免疫の役割に注意を払う必要があることが判明しました16。 全トランスクリプトーム配列決定と洗練された分析は、ncRNA の機能の特定と研究に役立ちます。 比較すると、tx-J マウスの海馬組織における全トランスクリプトーム プロファイルの ncRNA-miRNA-mRNA ce ネットワークの研究は現在報告されていません。

この研究は、ウィルソン病 (WD) 患者の海馬組織におけるコーディング RNA および非コーディング RNA 発現プロファイルの説明を提供します。 私たちは、差次的に発現する lncRNA、circRNA、および mRNA を同定し、新しいタンパク質間相互作用 (PPI) ネットワークおよび共発現ネットワークを構築しました。 さらに、DE-circRNA、lncRNA関連ceRNAネットワーク、およびGO/KEGG経路濃縮解析を利用して、それらの機能を包括的に予測しました。 最後に、定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) を使用して、WD に関連する遺伝子の発現を確認しました。 私たちの発見は、WD の根底にある分子機構と WD 関連の認知障害の診断と治療戦略のより良い理解に貢献します。

マウスは4日間の訓練プログラムを受けた後、5日目に位置決め巡航実験を行った。 実験では、WD グループとコントロール グループの間で、プラットホームの反対側の象限での脱出潜時と遊泳距離を比較しました。 結果は、WD グループが対照グループよりも有意に高い値を示し、統計的に有意な差があることが示されました (図 1a、b)。 さらに、プラットフォーム象限を除く 3 つの象限における平均脱出潜時と総遊泳距離を 2 つのグループ間で比較しました。 結果は、WDグループが対照グループよりも高い値を示し、統計的に有意な差があることがわかりました（図1c、d）。 これらの結果は、同じ訓練条件下では、tx-J マウスはプラットフォームを見つけるためにより多くの時間を要し、より長い距離を泳ぎ、通常のマウスよりも空間学習および記憶能力が著しく低いことを示唆しました。

MWM テストを通じて実行される空間学習と記憶能力の分析。 (a) 反対側のプラットフォーム象限の脱出潜時 (**P < 0.01)。 (b) 反対側のプラットフォーム象限の遊泳距離 (**P < 0.01)。 (c) プラットフォーム象限を除く 3 つの象限の平均脱出潜時 (*P < 0.05)。 (d) プラットフォーム象限を除く総水泳距離 (*P < 0.05)。

図2に示すように、ヘマトキシリンおよびエオシン染色の結果は、対照マウスのCA1領域錐体細胞の海馬が密に配置され規則正しく、滑らかな錐体細胞核と緻密な末梢神経フェルトを有し、いくつかのグリア細胞が散在し、良好な形態を示した。 、毛細血管が豊富です。 対照的に、WD グループの tx-J マウスの海馬錐体細胞は、数が減少し、緩く配置され、細胞間隔が広がり、錐体細胞レベルが大幅に減少し、軽度の浮腫、細胞質および核の染色が薄く、錐体細胞の局所的な喪失、透明でした。細胞の周囲にリング状のバンドがあり、顕著な細胞死の特徴が見られます (図 2a)。 免疫蛍光染色の結果は、対照群と比較して、WD群の海馬歯状回で生き残っている新しいニューロンの数が有意に減少していることを示しました（図2b）。

2 つのグループの海馬の形態学的変化。 (a) ヘマトキシリン・エオシン染色の結果（×400）。 図中の矢印は、海馬錐体細胞が浮腫状となり、細胞間隙が広がり、周囲に透明なリング状の帯が存在し、細胞死を示している。 (b) DAPI 染色、BrdU 標識、および海馬ニューロンの結合 (× 20 μm) の結果。 矢印は、WD グループの海馬で新しく形成されたニューロンの数が大幅に減少していることを示しています。

P < 0.05 および |log2FC|> 1.5 の基準に従って、EdgeR 法を使用して DE RNA を分析しました。 図3に示すように、ベン図、ボルケーノプロット、およびクラスタリングマップを使用してDE RNAを表示しました。図3a〜cは、DEGのベン図、ボルケーノプロット、およびクラスタリングヒートマップを示しています。 図 3d ～ f は、DEL のベン図、ボルケーノ プロット、クラスタリング ヒートマップを示しています。 図 3g–i は、DEC のベン図、ボルケーノ プロット、クラスタリング ヒートマップを示しています。 詳細情報は補足表 S1、S2、S3 に示されています。 tx-J 海馬における上方制御および下方制御される上位 20 の DEC/DEL/DEG に関する詳細情報を表 1、2、および 3 に示します。

DE RNA の発現プロファイル。 (a – c) DE mRNA の発現プロファイル。 (d – f) DE lncRNA の発現プロファイル。 (g – i) DE circRNA の発現プロファイル。 Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html) にプロットされたベン図 (a、d、g) は、WD グループと WD グループの重複する DE RNA の数を示しています。対照群。 OECloud ツール (https://cloud.oebiotech.com) を使用して実行された火山プロット (b、e、h) では、青色の点は下方制御された DE RNA を表し、赤色の点は上方制御された DE RNA を表します。 Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/) で作成したヒートマップ (c、f、i) では、青い四角形は DE RNA の減少を表し、赤い四角形は DE RNA の増加を表します。

全体として、対照群と比較して、合計 361 個の DE-mRNA (193 個のアップレギュレーションおよび 168 個のダウンレギュレーション)、2627 個の DE-lncRNA (1270 個のアップレギュレーションおよび 1357 個のダウンレギュレーション)、および 99 個の DE-circRNA (68 個のダウンレギュレーション)上方制御および下方制御) が tx-J 海馬で確認されました。

99 個の circRNA に RNA-seq の WD による重大な変化があることが判明したため、結果の信頼性は不明です。 信頼性を確認するために、3 つの上方制御された circRNA (mmu_circ_0001700、mmu_circ_0001662、および mmu_circ_00013859) と 3 つの下方制御された circRNA (mmu_circ_0001859、 mmu_circ_0000626 および mmu_circ_0000460)。 図 4 に示すように、qRT-PCR データは、WD グループでは、circRNA mmu_circ_0001700 および mmu_circ_0001662 が大幅に上方制御され、circRNA mmu_circ_0001859、mmu_circ_0000626、および mmu_circ_0000460 が大幅に下方制御されたことを示しています。 これらの結果は RNA-seq と一致しており、RNA-seq データが利用可能であることを示唆しています。

DE-circRNA 候補の qRT-PCR 検証。

我々は、図5aに示すDE mRNAとタンパク質の相互作用に基づいてPPIネットワークを構築しました。 相互作用に関する詳細情報は、補足表S4に記載されています。 最も高い次数値を持つ重要な遺伝子の上位 10 個 (Srsf1、Smarca2、Ppp1cc、Tia1、Ngf、Shank3、Ptk2b、Tcf3、Scn1a、Ikzf) を要約しました。

PPI ネットワークの可視化と DEG の機能強化分析。 (a) PPI ネットワークは Cytoscape (v3.9.1) を使用して特定されました。 度数の値が大きいほど、色は暗くなります。 (b) DEG の GO 濃縮分析は、OECloud ツール (https://cloud.oebiotech.cn) を使用して実行されました。 (c) DEG の KEGG 濃縮分析は、OECloud ツールを使用して実行されました。 (d) DEG のリアクトーム濃縮分析は、OECloud ツールを使用して実行されました。

微小管細胞骨格組織化 (GO: 0000226)、造血 (GO: 0030097)、ニューロン投射発達 (GO: 0031175)、細胞骨格 (GO: 0,005,856)、細胞質 (GO: 0005737) などの細胞成分を含む生物学的プロセスが豊富な GO 分析、およびシナプス（GO: 0045202）、膜貫通型受容体タンパク質チロシンキナーゼ活性化因子活性（GO: 0030297）、タンパク質結合（GO: 0005515）、およびハプトグロビン結合（GO: 0031720）を含む分子機能（図5b）。 KEGG 経路には、mRNA 監視経路 (mmu03015)、カルシウムシグナル伝達経路 (mmu04020)、アフリカトリパノソーマ症 (mmu05143)、およびドーパミン作動性シナプス (mmu04728) などが豊富に含まれています。 (図5c)。 リアクトーム濃縮は、p75NTRがシグナル伝達複合体をリクルートし（R-MMU-209543）、NF-κBが活性化されて生存をシグナルし（R-MMU-209560）、NRIFが核からの細胞死をシグナルする（R- MMU-205043)。 すべての濃縮結果は補足表 S5 に表示されました。

海馬の神経生理学および病理学に関連する2つのKEGGを、DEGとともに図6に示します。これには、長期電位（mmu04720）（図6a）およびグルタミン酸作動性シナプス（mmu04724）（図6b）が含まれます。

海馬の神経生理学および病理学に関連する 2 つの KEGG と DEG は、KEGG データベース (www.kegg.jp/フィードバック/copyright.html.) からの引用で示されました。 (a) 長期的な可能性 (mmu04720); (b) グルタミン酸作動性シナプス (mmu04724)。 緑色は遺伝子の下方制御を表し、赤色は遺伝子の上方制御を表します。

競合的内在性 RNA (ceRNA) 制御ネットワークは、さまざまなヒトの疾患において重要な役割を果たしています。 我々は、上記の差次的に発現したncRNAに基づいて、circRNA-miRNA-mRNAおよびlncRNA-miRNA-mRNAの三重制御ネットワークを構築した。 このネットワークの機能部分と潜在的なメカニズムは、機能強化分析によって評価されました。

この研究では、図7aに示すように、circRNA関連ceRNA制御ネットワークにおいて75の異なるcircRNA、1216のmiRNA、および333のmRNAを取得しました。 circRNA.1742、circRNA.3006、circRNA.4795、circRNA.7584、circRNA.9442 を含む 5 つの circRNA が中心的 circRNA となる可能性があると考えられ、mmu-miR-149-3p、mmu-miR-1946a、mmu- miR-1946b、mmu-miR-328-5p、mmu-miR-3470a、mmu-miR-3470b、mmu-miR-3473b、mmu-miR-3473d、mmu-miR-3547-5p、mmu-miR-6931- 5p および mmu-miR-7045-3p は、重要な miRNA と考えられました (図 7b-d)。 circRNA 7584/mmu-miR-1946a/Cacna1i、circRNA 7817/mmu-miR-6931-5p/Fosb などの関連する ceRNA 遺伝子ペアを導き出しました。circRNA 関連の ceRNA ネットワークに関する具体的な情報は補足表 S6 に提供されています。 12 のアルゴリズムに関する詳細情報は補足表 S7 にリストされています。

Cytoscape (v3.9.1) によって表示される circRNA-miRNA-mRNA ceRNA ネットワークの構築。 (a) CircRNA 関連の ceRNA ネットワーク。 赤いひし形のノードは有意に異なる circRNA を表し、青い長方形のノードは予測された miRNA を表し、ピンクの楕円ノードは予測された mRNA を表します。 (b) ceRNA ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子は、Degree 法によって計算されました。 (c) ceRNA ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子を EPC 法によって計算しました。 (d) ceRNA ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子を MCC 法によって計算しました。

2337個のlncRNA、113個のmiRNA、および330個のmRNAを含むlncRNA関連ceRNAネットワーク、および上位500個の遺伝子を含むネットワークマップを図8aに示します。 計算後、ENSMUST00000145250、ENSMUST00000180800、NONMMUT015424.2 が中心 lncRNA、mmu-miR-1195、mmu-miR-1893、mmu-miR-1946a、mmu-miR-3470b、mmu-miR-3473d、mmu-miR とみなされました。 -3620-3p、mmu-miR-3960、mmu-miR-5126、mmu-miR-6931-5p はハブ miRNA とみなされました（図 8b-d）。 NONMMUT115700.1/mmu-miR-3473d/Mob1b、NONMMUT015424.2/mmu-miR-5126/AL592169.1、ENSMUST00000180800/mmu-miR-5126/Shank3 など、重要な役割を持つ可能性のあるいくつかの ceRNA 遺伝子ペアを特定しました。 lncRNA関連のceRNAネットワークに関する具体的な情報は補足表S8に提供され、12のアルゴリズムに関する詳細情報は補足表S9にリストされています。

Cytoscape (v3.9.1) によって表示される lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA ネットワークの構築。 (a) LncRNA 関連の ceRNA ネットワーク。 紫色の三角形のノードは有意に異なる lncRNA を表し、オレンジ色の丸い長方形のノードは予測された miRNA を表し、濃い灰色の六角形のノードは予測された mRNA を表します。 (b) ceRNA ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子がクラスター係数法によって計算されました。 (c) ceRNA ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子を EPC 法によって計算しました。 (d) ceRNA ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子は、ストレス法によって計算されました。

2 つの ceRNA ネットワーク内の mRNA を個別にターゲットにして、GO/KEGG 濃縮分析を実行しました。 mRNAを標的とするcircRNA関連ceRNAの機能強化ネットワークを図9aに示します。 下方制御されたmRNA機能濃縮のGOおよびKEGGの結果を図9b、cに示しました。 細胞接合部（GO: 0030054）、細胞投影（GO: 0042995）、シナプス（GO: 0045202）、細胞質小胞（GO: 0031410）、および KEGG 分析（図 9c）が豊富な GO 分析（図 9b）アンフェタミン中毒 (mmu05031)、心筋細胞におけるアドレナリン作動性シグナル伝達 (mmu04261)、タイトジャンクション (mmu04530) など。 上方制御されたmRNA機能濃縮のGOおよびKEGGの結果を図9d、eに示しました。 細胞質（GO: 0005737）、タンパク質結合（GO: 0005515）、核（GO: 0005634）、金属イオン結合（GO: 0046872）が豊富なGO分析（図9d）、および以下が豊富なKEGG分析（図9e） Ras シグナル伝達経路 (mmu04014)、PI3K-Akt シグナル伝達経路 (mmu04151)、サルモネラ感染症 (mmu05132) など。濃縮の結果は補足表 S10 に表示されました。

OECloud ツール (https://cloud.oebiotech.com) を使用して分析された、circRNA をターゲットとした mRNA のエンリッチメント ネットワーク分析。 (a) mRNA をターゲットとする circRNA 関連 ceRNA の機能強化ネットワーク。 (b、c) circRNA を標的とした下方制御された mRNA の GO/KEGG 用語の遺伝子の数。 （ d 、 e ）tx-Jマウスの海馬におけるcircRNAを標的とした上方制御されたmRNAのGO / KEGG用語の遺伝子の数。

mRNAを標的とするlncRNA関連ceRNAの機能強化ネットワークを図10aに示す。 下方制御されたmRNA機能濃縮のGO/KEGG結果を図10b、cに示した。 オキシドレダクターゼ活性 (GO: 0016491)、カルシウムイオン結合 (GO: 0005509)、微小管ベースの運動 (GO: 0007018)、微小管 (GO: 0005874)、頂端細胞膜 (GO: 0016324) が豊富な GO 分析 (図 10b) ）、神経変性複合疾患の経路（mmu05022）、ハンチントン病（mmu05016）、神経活性リガンド-受容体相互作用（mmu05014）などが豊富なKEGG分析（図10c）。上方制御されたmRNA機能のGOおよびKEGGの結果濃縮は図10d、eに示されています。 サイトカイン産生（GO: 0001817）、生体異物代謝プロセス（GO: 0006805）、ユビキチンリガーゼ複合体（GO: 0000151）の調節が豊富なGO分析（図10d）、およびユビキチン媒介タンパク質分解が豊富なKEGG分析（図10e） (mmu04120)、神経変性複合疾患の経路 (mmu05022) など。すべてのエンリッチメント結果は補足表 S11 に表示されました。

OECloud ツール (https://cloud.oebiotech.com) を使用して分析された lncRNA をターゲットとした mRNA のエンリッチメント ネットワーク分析。 (a) mRNA をターゲットとする lncRNA 関連 ceRNA の機能強化ネットワーク。 (b、c) lncRNA を標的とした下方制御された mRNA の GO/KEGG 用語の遺伝子の数。 （ d 、 e ）tx-Jマウスの海馬におけるlncRNAを標的とした上方制御されたmRNAのGO / KEGG用語の遺伝子の数。

図11aに示すように、ピアソン相関係数|r|> 0.7およびP <0.05に基づいて、92個のcircRNAおよび397個のmRNAを含む2051個のcircRNA-mRNA共発現遺伝子対を得た。 このうち、最も相関の高い 5 つの circRNA は、「circRNA.1641」、「circRNA.2061」、「circRNA.4258」、「circRNA.4898」、「circRNA.7366」、「circRNA.7621」です。 アルゴリズムベースのサブネットワークを図 11b ～ d に示します。 circRNA-mRNAペアに関する情報は補足表S12に表示され、12のアルゴリズムに関する詳細情報は補足表S13にリストされています。

Cytoscape (v3.9.1) によって表示された circRNA-mRNA 共発現ネットワークおよびサブネットワークの視覚化。 (a) CircRNA-mRNA 共発現ネットワーク。 赤いひし形のノードはcircRNASを表します。 ピンクの日食ノードは mRNA を表します。 (b) circRNA-mRNA 共発現ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子を MCC 法により計算しました。 (c) circRNA-mRNA 共発現ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子は、Radiality 法によって計算されました。 (d) circRNA-mRNA 共発現ネットワークの上位 10 位のハブ遺伝子をストレス法により計算しました。

図12aでは、2627個のlncRNAと361個のmRNAを使用して、同じ閾値でlncRNA-mRNA共発現ネットワークを構築しました。 「MSTRG.18029.6」、「MSTRG.24543.1」、「NONMMUT014183.2」、「NONMMUT059281.2」、「NONMMUT072370.2」、「NONMMUT072383.2」、「NONMMUT147148.1」を含む8つのlncRNAが重要なlncRNAとして特定されました。 、「NONMMUT148168.1」。 3 つのアルゴリズムに基づくサブネットワークを図 12b ～ d に示します。 lncRNA-mRNA 遺伝子ペアに関する情報は補足表 S14 にリストされ、12 のアルゴリズムに関する詳細情報は補足表 S15 にリストされています。

Cytoscape (v3.9.1) によって表示された lncRNA-mRNA 共発現ネットワークおよびサブネットワークの視覚化。 (a) LncRNA-mRNA 共発現ネットワーク。 紫色の三角形のノードは lncRNA を表します。 濃い灰色の六角形のノードは mRNA を表します。 (b) Closeness 法は、lncRNA-mRNA 共発現ネットワーク内の上位 10 個のハブ遺伝子の発現マップを計算します。 (c) EPC 法は、lncRNA-mRNA 共発現ネットワークの上位 10 位の中心遺伝子の発現マップを計算します。 (d) Stress メソッドは、circRNA-mRNA 共発現ネットワークの上位 10 個のハブ遺伝子の発現マップを計算します。

現在の研究は、WD の tx-J マウス モデルの海馬における circRNA、lncRNA、および mRNA の最初のトランスクリプトーム解析です。 これらのモデルでは、差次的に発現されるcircRNA、lncRNA、およびmRNAが、WDで認知障害が発生するメカニズムと関連しています。 私たちは、ceRNA ネットワークにおけるノンコーディング RNA の関与成分と、それらが細胞機能に及ぼす影響に焦点を当てました。 私たちは、WD における認知障害を制御する ceRNA ネットワークにおける非コーディング RNA の特徴的な関与を解析します。これは、分子レベルでの WD における認知障害の診断または予後のためのバイオマーカーの探索に貢献します。

RNA の転写と代謝の変化が複雑な症状や疾患の発症に重要であることを示唆する証拠が増えています。 非コーディング RNA は生物のトランスクリプトームの大部分を占めており、中枢神経系に豊富に存在し、RNA の転写制御に深く関与しているため、多くの神経症状や疾患のメカニズムに関与しています 17。 いくつかの研究では、コーディング RNA と非コーディング RNA が miRNA の結合を通じて転写を調節し、それによって下流の標的遺伝子発現に影響を与えることが示されており、これは競合内在性 RNA 機構として知られています 18。 この遺伝子制御パターンは、種や表現型の複雑さを説明するために使用できます19。

研究によると、WD 患者の最大 60% が、運動、認知、行動の欠陥を含む神経学的または精神医学的症状を発症時に示しており 20、「銅解毒」で治療された患者や慢性疾患患者にも持続的または進行性の認知機能障害が存在することが示されています。または脳に銅が蓄積しない21。 前述したように、tx-J マウスは現在、WD および関連表現型のトランスクリプトーム配列決定を研究するための理想的なモデルです。 この研究では、水迷路テストを通じて、tx-J マウスに空間学習能力や記憶能力の低下などの認知障害の存在を確認しました。 一方、海馬構造の形態学的検査に関しては、tx-Jモデルマウスでは海馬歯状回領域の神経細胞の破壊が認められました。 これらは、新しい神経細胞の数を大幅に減少させました。 これは、対照と比較して、tx-J マウスには検出可能な認知障害があることを示しています。 一方で、認知障害のこの証拠は、動物モデルの科学性を向上させ、配列決定結果の信頼性を強化することができます。

本研究では、WDモデルtx-Jマウスの海馬組織において、mRNA\circRNA\lncRNAの発現差解析を行い、PPI発現ネットワークとncRNA関連ceRNAネットワークおよびncRNA/mRNA共発現ネットワークを構築した。初めて。 361°をスクリーニングしました。 これらの有意に差次的に発現される標的遺伝子の多くは、認知障害の病理と密接に関連しています。 我々は、ncRNA関連ceRNA制御ネットワークにおいてmiRNAが標的とする一部のmRNA（Fosb、Shank3、Cacna1iなど）も差次的に発現するmRNAであることを発見した。

Fosb は、半減期が長いため蓄積して慢性的な細胞活動中に保持される活性依存性の転写因子です 22。 Fosbは海馬の記憶の調節において重要な役割を果たします。 研究により、Fosb ファミリーがヒストン修飾を通じて重要な標的遺伝子の多くの依存症関連標的を制御していることが確認されています 23。 海馬における Fosb の過剰発現が学習と記憶に影響を与える可能性があることも実証されています 24。 認知機能障害のある AD モデルマウスにおける遺伝子発現の Fosb 制御を調べた研究では、Fosb がプロモーターに結合してヒストンの脱アセチル化を引き起こすことによって、可塑性と認知に重要な初期遺伝子である c-Fos の発現を抑制する可能性が示唆されています。 Fosb の生涯は、それが認知障害の持続の原因である可能性を示唆しています25。 興奮性シナプス後足場タンパク質として、SHANK3 はさまざまなシナプス後密度タンパク質に作用して、シナプス後神経伝達物質受容体およびシグナル伝達分子を調節します 26。 自閉症スペクトラム障害（ASD）における単一遺伝子変異レベルの予測に基づく研究では、SHANK3 mRNAレベルがマウスの海馬におけるシナプス伝達に影響を及ぼし、長期的なうつ病や学習と記憶の長期的な障害を引き起こす可能性があることが示されました27。 電位依存性カルシウム（Cav）チャネル遺伝子CACNA1I（Cav3.3）は統合失調症の危険因子と考えられており、この遺伝子の変異はニューロンの興奮性や脳ネットワーク活動の破壊を引き起こし、伝達物質放出などのプロセスに影響を与えることが判明した。 、感覚、記憶、睡眠28．

ノンコーディング RNA は、タンパク質をコードしない RNA 分子のクラスであり、哺乳類ゲノムの全 RNA の約 98 ～ 99% を占めます 29。 ノンコーディング RNA が他の分子と積極的に相互作用することによって重要な制御的役割を果たしているという証拠が増えています。 例えば、非コードRNAは1つまたは複数の標的分子と相互作用して細胞または経路を調節し、神経疾患の調節を含む正常な生理学的または病理学的プロセスに影響を与えます30。 CircRNA は、5' キャップと 3' ポリアデニル化尾部をもたない共有結合で閉じた一本鎖環状分子の一種であり 31、安定で豊富で保存されており 32、医学研究において独自の可能性を秘めています。 この研究では、WD の海馬組織における circRNA プロファイルを特定し、99 個の有意な DEC がスクリーニングされました。 特に、mmu_circ_0001859 および mmu_circ_0000242 は、軸索ガイダンス、Wnt シグナル伝達経路、カルシウムシグナル伝達経路、MAPK シグナル伝達経路、局所接着、ニューロトロフィンシグナル伝達経路、TGF-β シグナル伝達経路、細胞周期、ErbB シグナル伝達経路、Notch シグナル伝達経路、p53 と強く関連していました。シグナル伝達経路、Fc ガンマ R 媒介性食作用など。

研究により、核内での転写制御への関与、miRNA の内因性吸着体、タンパク質またはペプチド翻訳の鋳型、および遺伝子発現の調節因子としての役割など、circRNA の生物学的機能が確認されています 33。 CircRNA は哺乳類の脳に非常に豊富に存在し、神経分化中に全体レベルで上方制御され、神経シナプスに非常に豊富に存在し、精神神経疾患の発症に重要な役割を果たしています 34。 深層RNA配列解析に基づく研究により、ADモデルマウス（APP/PS1マウス）の頭蓋circRNA関連ceRNA機構が系統的に解明され、このモデルマウスにおけるcircRNA関連ceRNAネットワークが主に樹状突起の発生と記憶に関与していることが判明した（ Sorbs2) およびマウス神経発達 (ALS2) は、AD35 の臨床診断と治療に新しいアイデアを提供します。 POCDを有する高齢マウスにおける海馬のcircRNA発現プロファイルの最初の調査は、mmu_circRNA_22058およびcircRNA_44122\Egfr ceRNAネットワーク、またはcircRNA_22673\Prkacb ceRNAネットワークがPOCD疾患の経過に意味のある関与を持っている可能性があることを示唆しています36。 この研究では、WD モデル tx-J マウスの海馬組織において、対照と比較して有意に差次的に発現する 99 個の circRNA を同定しました。 我々は、差次的に発現したcircRNAに基づいてceRNAネットワークを構築し、機能濃縮解析を実施した。 我々は、circRNA関連ceRNAネットワークの上方制御遺伝子と下方制御遺伝子の両方に対してGOおよびKEGG解析をそれぞれ実行し、神経疾患および認知プロセスに関連する一連の豊富な用語を特定した。 我々の結果では、上方制御された遺伝子のGOは、細胞質（GO: 0005737）、タンパク質結合（GO: 0005515）、核（GO: 0005634）、および金属イオン結合（GO: 0046872）に濃縮されていました。 対照的に、KEGG は Ras シグナル伝達経路 (mmu04014)、PI3K-Akt シグナル伝達経路 (mmu04151)、カルシウムシグナル伝達経路 (mmu04020) などに濃縮されていました。下方制御された遺伝子の GO は細胞接合部に濃縮されていました (GO: 0030054)。細胞投影 (GO: 0042995)、シナプス (GO: 0045202)、および細胞質小胞 (GO: 0031410)、KEGG はアンフェタミン中毒 (mmu05031)、心筋細胞におけるアドレナリン作動性シグナル伝達 (mmu04261)、タイトジャンクション (mmu04530)、概日リズムで豊富でした。同調 (mmu04713)。 我々は、WDにおける認知障害の進行に寄与する可能性のあるいくつかのceRNAネットワークを特定した。 たとえば、mmu-miR-6931-5pをコアとして、Fosbを標的遺伝子とするceRNAネットワークでは、上流の44個のcircRNAがスポンジとしてmmu-miR-6931-5pに結合し、Fosb標的遺伝子の発現を制御する可能性がある。

circRNA とは異なり、LncRNA は 200 ヌクレオチドよりも長く、5' エンドキャップと 3' 末端多量体テールを備えているため、オリゴヌクレオチドベースの RNA シークエンシングによって容易に認識されます 37。 脳における lncRNA の発現は組織特異的であり 38、研究により、海馬、前頭前皮質、扁桃体などの認知に関連する記憶脳領域における lncRNA の局所的および細胞特異的発現パターンの存在が確認されています 39。マウスの海馬組織に著しく豊富に含まれており、アルツハイマー病やてんかんなどの疾患において重要な役割を果たしています。 インビボまたはインビトロモデルで認知関連性を持つ多くの lncRNA が実証されています。 たとえば、LncRNA Rian は miR143-3p を負に制御することで LIMK1 の発現を低下させることができます。 したがって、LncRNA Rian/miR143-3p/LIMK1 軸の調節により、セボフルラン麻酔後の認知機能障害を改善できる可能性があります 40。 AD モデルラットの認知機能に対する LncRNA MEG3 の作用機序に関する研究では、LncRNA MEG3 の上方制御が AD ラットの神経損傷を抑制し、Aβ 陽性発現を減少させ、炎症指数を改善し、認知機能も改善することが示されました 41。 血管性認知障害のマウスモデルでは、LncRNA TUG1 は BDNF タンパク質と結合して相互作用することがあり、その過剰発現は VCI42 後のマウスで認知機能障害を引き起こす可能性があります。 我々は、WDモデルtx-Jマウスの海馬組織において2627個のDELを同定し、構築したlncRNA関連ceRNAの機能濃縮解析を行った。 その中で、上方制御された標的遺伝子 GO は、サイトカイン産生 (GO: 0001817)、生体異物代謝プロセス (GO: 0006805)、ユビキチンリガーゼ複合体 (GO: 0000151)、後期エンドソーム (GO: 0005770)、ユビキチン-結合酵素活性 (GO: 0061631)、転写コリプレッサー活性 (GO: 0003714)、ユビキチン媒介タンパク質分解における KEGG 濃縮 (mmu04120)、神経変性の経路 - 複数の疾患 (mmu05022)。 標的遺伝子の下方制御された発現 GO は、酸化還元酵素活性 (GO: 0016491)、カルシウムイオン結合 (GO: 0005509)、微小管ベースの運動 (GO: 0007018)、微小管 (GO: 0005874)、頂端細胞膜 (GO) が豊富です: 0016324)、繊毛 (GO: 0005929)。 KEGG 分析は、神経変性の経路 - 複数の疾患 (mmu05022)、ハンチントン病 (mmu05016)、筋萎縮性側索硬化症 (mmu05014)、神経活性リガンド-受容体相互作用 (mmu04080) に充実しています。 例えば、SHANK3を標的とするceRNAネットワークでは、上部lncRNA NONMMUT015424.2 (lncRNA D130020L05Rik)はmmu-miR-5126をスポンジとして使用し、それに結合することによってSHANK3の転写発現を調節する可能性がある。 我々の予測された ncRNA-ceRNA ネットワーク モデルは、WD における認知障害の発症に寄与する可能性があり、これらのネットワークの機能についてはさらなる実験的検証が必要です。

この論文で紹介された研究にはいくつかの制限があります。 まず、サンプルサイズが小さいため、結果の一般化可能性が制限される可能性があります。 さらに、動物モデルから得られた結果は、雌マウスやヒト患者を含むウィルソン病 (WD) のすべての表現型の転写プロファイルを完全に表しているわけではない可能性があります。 第二に、マウスの空間学習と記憶の評価は十分に包括的ではなかった可能性があります。 さらに、この研究はWD動物モデルにおける海馬の転写プロファイルのみを調査しており、他の銅沈着組織は調査されていません。これは、異なる組織での遺伝子発現を調査することができなかったことを意味します。 さらに、この研究結果には、有意な発現差のある遺伝子や予測ネットワークモデルなどの実験的検証が欠けており、結果の証拠を提供するには堅牢な実験が必要です。 私たちの研究はトランスクリプトミクスに基づいてWDにおける認知障害のメカニズムを解明しましたが、転写分子の発現制御機構は複雑であり、エピジェネティック修飾の制御などさらなる研究が必要であることを認識しています。

結論として、病気の病理学的表現型メカニズムを調査することは、困難で時間のかかる仕事です。 しかし、ハイスループットシーケンス技術の進歩により、疾患の根底にある分子機構の探索が大幅に促進されました。 ウィルソン病（WD）のモデルであるtx-Jマウスの海馬組織におけるタンパク質間相互作用（PPI）ネットワークと非コードRNA競合内因性RNA（ncRNA-ceRNA）ネットワークの調査は、ウィルソン病（WD）のモデルを特定する上で重要な意味を持っています。 WD における認知障害の診断、治療、および薬剤の開発に不可欠な潜在的なバイオマーカーと目標値。

この研究では、ジャクソン研究所から入手した体重20±2gの雄tx-Jマウス（C3HeB/FeJ-Atp7b tx-J/J）10匹と、生後8～10週の雄野生型マウス（C3HeB/FeJ）10匹を利用した。北京バイタルリバー研究所動物技術株式会社 すべてのマウスは、湿度 (50 ～ 70%)、室温 (18 ～ 22 °C)、および個別の空気供給が制御されたケージに個別に収容され、餌と水は自由に摂取できました。 12時間の明暗サイクルを8週間繰り返します。 この研究では、動物のサブグループが重複していました。 4匹のtx-Jマウスのうち3匹はMWM検査後にハイスループットシーケンスを受け、残りの7匹のマウスのうち4匹は海馬の組織病理学検査を受け、残りの3匹はqRT-PCR実験を受けた。 野生型マウスもこのプロトコールに従って治療した。 エストロゲンは、いくつかの脳領域の神経可塑性に影響を与え、ニューロンのシナプスと海馬の形成を調節および仲介し、学習と記憶に影響を与えることが示されています43。 したがって、これらの影響を最小限に抑えるために、雄のマウスが研究対象として選ばれました。

この研究で使用された方法は、ARRIVE2.0 ガイドラインの関連ガイドラインと規制に従って実行されました44。 安徽省中医薬大学の実験動物倫理委員会は、動物使用プロトコルを審査し、承認しました (許可番号: AHUCM-mouse-2021125)。

モリス水迷路実験は、げっ歯類の空間学習と記憶能力を評価するために日常的に使用されます。この実験は、21 ～ 23 °C の高さ 45 cm の水を満たし、水と混合した黒い円形のプール (高さ 50 cm、直径 90 cm) で構成されていました。白色の無毒、無臭の染料で、黒い円形のテーブルが第 4 象限の中央の水深 1 cm に固定されています。 2 つのグループのそれぞれから 4 匹のマウスが実験のために選択されました。 測位ナビゲーション実験では、2 つのグループのマウスを、東、西、南、北の 4 つの象限のいずれかのプール壁に面した 45 度の角度の位置から水中に入れ、1 日 4 回テストしました。 マウスが 60 秒以内に隠れたプラットフォームに登り、そのプラットフォームに 5 秒以上留まった場合、マウスはプラットフォームを見つけたとみなされました。 水の侵入からプラットフォームの発見までの時間を脱出潜時として記録した。 マウスが 60 秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合は、マウスをプラットフォームに誘導し、そこに 10 秒間留まり、脱出潜時を 60 秒として記録しました。 反対側のプラットフォーム象限の脱出潜時、プラットフォーム象限を除く 3 つの象限の平均脱出潜時、反対側プラットフォーム象限の水泳距離、および 5 日目のプラットフォーム象限を除く総水泳距離を 2 つのグループ間で比較します。 。

各グループから 4 匹のマウスを海馬の組織病理学のために選択しました。 マウスを１２時間絶食させた後、ペントバルビタールナトリウム（２ｍＬ／ｋｇ；上海化学試薬会社）の腹腔内注射により麻酔し、両側海馬組織を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、エタノールおよびキシレンで脱水し、透明パラフィンに包埋し、切片化した。遅延させ、ヘマトキシリン・エオシンで染色し、さらに脱水して密封し、光学顕微鏡で観察します。

アイスボックス上でWD群と対照群の海馬組織を分離した後、3匹の対照マウスと3匹のtx-Jマウスの海馬からのリボソームRNAサンプルのディープシーケンスを実行しました。

末梢血単核球 (PBMC) の全 RNA は、MiRNeasy Mini Kit (Qiagen、ドイツ) を使用して調製されました。 その後、RNA Clean XP キット (カタログ番号 A63987、Beckman Coulter、米国) および RNase-Free DNase セット (カタログ番号 79254、Qiagen、ドイツ) を使用して全 RNA を精製しました。 精製された RNA は、RNA の含有量と品質を検出するための 2 つの機器、NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific、米国) と Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies、米国) を使用して定量されました。 メーカーの説明書に従って、truseq® 鎖トータル RNA サンプル調製キット (Illumina、USA) を使用してライブラリーを調製しました。 Qubit 2.0 蛍光光度計を使用してライブラリを定量しました。 さらに、これらのライブラリは Agilent 2100 Bioanalyzer によって検証されました。 挿入されたフラグメントのサイズとモル濃度を確認した後、ライブラリーを CBOT で 10 pm に希釈してクラスターを生成し、Illumina HiSeq 2500 (Illumina、USA) で配列決定しました。 このライブラリーは、OG Biotech Inc (Aoji Biotech、上海、中国) で構築および配列決定されました。

FastQC (v. 0.11.3、http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)45 を使用して、RNA-Seq リードを定量化しました。 Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) は、Illumina TruSeq のアダプター配列、mm10 リボソーム RNA リード、および低品質リードを削除します。 次に、Hisat2 (バージョン: 2.0.4) を使用して、トリミングされたリードを Ensembl からダウンロードしたマウス参照ゲノム (mm10) にマッピングしました。 アラインメントされたリード内の各遺伝子の数は、StringTie (バージョン 1.3.0) によって検出されました。 Perl スクリプトを使用して、100 万マッピングされたリードあたりの転写産物の 1 キロベースあたりの遺伝子数とフラグメント (FPKM) の正規化を実行しました。

circRNA の場合、すべての有効な配列決定データは次の手順を使用して処理されました。1) データは BWA-MEM ソフトウェア (バージョン: 2.0.4) によってマウス ゲノム (http://genome.ucsc.edu/)46 に合わせて整列されました。 2) ゲノムに連続してアラインメントされたリードは破棄されました。 3) マッピングされていないリードは、CIRI アルゴリズムを使用してバックスプライス接合部位について明示的に分析され、可能性のある circRNA 47 を特定し、カウントは SRPBM (Spliced Reads Per Billion Mapping) によって正規化されました。 個々の circRNA を生成する遺伝子は、BED ツールを使用して circRNA のゲノム位置を TopHat/Cufflinks によって検出された位置と照合することによって同定されました 48。 ヒトとマウスの間の circRNA の保存は、UCSC Liftover ツールを使用して分析されました。 これは、調節不全の各 circRNA の 3' および 5' フランク座標をヒトゲノム座標にマッピングするために利用されました。 相同性の基準は、推定上のヒト部位の周囲±2ヌクレオチド距離以内にあるスプライス部位を検出することであった49。

lncRNA を同定するために、転写アセンブリ ソフトウェア StringTie を使用して長さ 2 × 150 bp (PE150) の単一レーンのペアリードを組み立て、長さ 200 bp 未満の既知の mRNA および転写産物を除去しました。 予測ソフトウェア: lncRNA 予測用のコーディング ポテンシャル カリキュレーター (https://github.com/biocoder/cpc) およびコーディング ノンコーディング インデックス (https://github.com /www-bioinfo-org/CNCI#install-CNCI)次に、残りの転写産物を lncRNA データセットからフィルタリングしました。 lncRNA の発現レベルは、100 万マッピングリードあたりのエクソンモデルのキロベースあたりのフラグメント (FPKM) によって測定され、さまざまなサンプルにおける既知の遺伝子の発現量が FPKM 値から計算されました。

EdgeR 法を使用して、差次的に発現する遺伝子を決定しました (P < 0.05 および |log2FC|> 1.5)。 ベン図は Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)50 にプロットされています。 火山マップは、https://cloud.oebiotech.com の OECloud ツールを使用して実行されました。 ヒート マップは Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/)51 で作成されました。

リアルタイム qRT-PCR は以下の反応系で実行されました: 3.6 μL RNase-free H2O、0.2 μL フォワードプライマー (5 μM)、0.2 μL リバースプライマー (5 μM)、1 μL cDNA テンプレート、および 5 μL SYBR グリーン スーパーミックス(Abclonal、武漢、中国) 95 °C で 30 秒、続いて 15 秒反応、次に -60 °C で 15 秒、70 °C で 15 秒の反応を 40 回繰り返しました。 プライマーは、OG Biotech Inc (Aoji Biotech、上海、中国) によって設計および合成されました。 circRNA の相対発現レベルは 2-ΔΔCT として表されました。

STRING データベース (https://cn.string-db.org/) は、実験的な相互作用だけでなく、DE の相互作用を予測するために使用された予測相互作用も含む、タンパク質間の相互作用に関する情報を提供する統合データベースです。 mRNA とタンパク質。 PPI ネットワークの構築には Cytoscape (v3.9.1) が使用されます。 MCAO プラグインと標準セットを使用すると、PPI ネットワークのモジュールが Cytoscape で識別されました。 GO および KEGG 経路濃縮分析は、OECloud ツール (https://cloud.oebiotech.cn) を使用して実行されました。 Pathview Web サイト (https://pathview.uncc.edu/) を通じて DEG と関連パスを視覚化します。

マウス由来 miRNA のすべての配列は、miRBase バージョン 2152 から取得しました。DEC および DEL と相互作用する miRNA ターゲットを予測するために、miRanda ソフトウェアと RNAhybrid に基づく OG-Biotech のカスタム ソフトウェアが採用されました。

予測された結合 miRNA の数をすべての circRNA についてカウントしました。 予測された結合 miRNA の mRNA ターゲットは、miRdana53、targetScan54、および mirTarbase55 データベースから収集されました。 Venny は、少なくとも 2 つのデータベースによって予測される、強力にサポートされている mRNA ターゲットを取得するために使用されました。 同じ miRNA 結合部位を共有する DEC と mRNA は、circRNA-miRNA-mRNA 相互作用を示しました。

隣接する標的遺伝子に作用するlncRNAのシス作用性の役割について、lncRNAの10kb/100kb上流および下流をコードする遺伝子を検索し、その機能を解析した。 発現レベルに基づいて同定されたlncRNAのトランス作用性の役割について、lncRNAとコード遺伝子との間の発現相関をR関数「cor.test」を用いて計算した。 ceRNA ネットワークは Cytoscape ソフトウェアによって視覚的に表示されました。

ハブ遺伝子は、Cytohubba プラグインの関連アルゴリズムを使用して計算され、表示されます56。 これら 12 のアルゴリズムには、次数、エッジ浸透成分 (EPC)、最大近傍成分 (MNC)、最大近傍成分の密度 (DMNC)、最大クリーク中心性 (MCC)、および 6 つの中心性 (ボトルネック、離心性、近接性、放射性、中間性、およびストレス) は最短経路とクラスタリング係数に基づいて計算されます。 すべてのアルゴリズムと結果として得られるネットワーク図は、補足図に示されています。 S1とS2。

GO 分析では、生物学的プロセス (BP)、細胞成分 (CC)、および分子機能 (MF) 分析が実行されました。 DE circ-/lnc-/mRNA の機能をさらに理解するために、OECloud ツール (https://cloud.oebiotech.com) を使用して、強化されたジーンオントロジー (GO) および京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) 経路を分析しました。 tx-Jマウスのトランスクリプトームの細胞、生物、生態系などの高度な機能と有用性を明らかにします。 GO および経路の有意な濃縮条件は、P < 0.05 の閾値に従って選択されました。

DEL/DEC/DEGのマトリックスデータに基づいて、DEL/mRNAとDEC/mRNAの間のピアソン相関係数がそれぞれ計算され、上/下を取得するための|r|> 0.7およびP <0.05の閾値が計算されました。 -DEL/mRNA と DEC/mRNA 間の制御された共発現リスト。 共発現ネットワークの視覚化は、cytohubba プラグインの 12 のアルゴリズムを使用して計算および表示されました。 すべてのアルゴリズムと結果として得られるネットワーク図は、補足図に示されています。 S3とS4。

統計分析は、Graphpad Prism 8 (米国シカゴ) を使用して実行されました。 結果は平均値±標準偏差 (SD) として表示されます。 残りのデータに対してスチューデントの t 検定が実行され、P < 0.05 が統計的に有意であるとみなされました。

この論文で報告された生​​の配列データは、中国国家生命情報センター/中国科学院北京ゲノミクス研究所の国立ゲノミクスデータセンター (Nucleic Acids Res 2022) のゲノム配列アーカイブ (ゲノミクス、プロテオミクス、バイオインフォマティクス 2021) に保管されています。科学57,58。 シーケンスの形式は https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA010567 であり、バイオプロジェクトへの作業リンクは https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA012480 です。

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データ分析にご協力いただいた Qiang Fan 氏 (Aoji Bio-tech Co., Ltd.、中国、上海) に感謝します。

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Daojun Xie、Juan Zhang、Bo Yang、Lei Zhou、Xiaofeng Huang

安徽中医薬大学統合中西洋医科大学、No. 1 Qianjiang Road、Xinzhan District、Hefei、230012、中華人民共和国

ダン・ワン＆ビャオ・カイ

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DJX、JZ、BC、BY、LZ、XFH、DW がこのアイデアを考案しました。 DW と XFH は文献を検索しました。 DW は動物実験と材料を実施しました。 DW は DJX、JZ、BCDW の助けを借りて原稿を作成しました。BY、LZ、XFH の助けを借りて図を描き、参考文献を修正しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

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転載と許可

Wang, D.、Xie, D.、Zhang, J. 他。 ウィルソン病のtx-J動物モデルにおける海馬組織のコーディングおよび非コーディングRNAトランスクリプトーム発現プロファイルの包括的な分析。 Sci Rep 13、9252 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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受信日: 2022 年 9 月 29 日

受理日: 2023 年 6 月 5 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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